Методом КАРС получены цифровые изображения распределения липидов в клетке. В качестве образца использовались человеческие раковые Mia-PaCa pancriatic клетки. На примере F-САRS изображения ТЕ мозговых клеток проиллюстрирована возможность применения Рамановских меток для повышения селективности изображения.

Прогресс клеточной биологии и медицины связан с методами и оборудованием, позволяющими проводить бесконтактный структурный анализ биологических образцов и процессов в них с высоким разрешением и в реальном времени. Оптическая лазерная микроскопия обладает неоспоримыми преимуществами и успешно дополняет физико-химические, радиационные, электронно-лучевые методы анализа. Конфокальная флуоресцентная лазерная микроскопия в сочетании с достижениями в нанофотонике и синтезе флуоресцентных меток, селективно взаимодействующих с компонентами клетки, позволяет изучать состав и структурные превращения клетки. Для нефлуоресцирующих образцов либо биологически не совместимых с внедряемыми флуоресцентными метками в силу их токсичности, либо подверженных сильному фотовыцветанию флуорофоров в качестве контрастного механизма формирования сигнала могут быть использованы молекулярные колебательные свойства входящих в состав биологических объектов органических соединений.

 К числу перспективных направлений оптического анализа биологических обьектов на клеточном уровне, основанных на характерных колебательных резонансах, относятся Рамановская микроспектроскопия, микроскопия Спонтанного рамановского рассеяния (СРР) и Когерентного анти-стоксового рамановского рассеяния (КАРС). В отличие от СРР с присущими ему ограничениями вследствие слабости сигнала и большой величины автофлуоресцентного фона, КАРС-отклик среды нелинейно зависит от мощности возбуждающего сигнала и, как минимум, на пять порядков превышает сигнал СРР.

Широкое применение оптических методов активного и спонтанного Рамановского рассеяний связано с перспективами в изучении меж- и внутриклеточных взаимодействий, селективных процессов на уровне мембраны, цитоплазмы, липидов, ядер и присущих им РНК- и ДНК-взаимодействий.

Диагностика и лечение онкологических заболеваний напрямую связаны с методами и оборудованием для бесконтактного структурного клеточного анализа биологических образцов и in situ процессов в них. Разработка лекарственных препаратов и методов лечения таких заболеваний базируется на осмыслении происходящих в клетке процессов, изучении внутриклеточных превращений и их особенностей, селективных свойств взаимодействия реагентов на клеточном уровне. При этом эффективность препаратов определяется главным образом управляемостью процессов их селективного взаимодействия с внутриклеточной структурой. 

Когда на среду с отличной от нуля нелинейной восприимчивостью третьего порядка χ⁽³⁾ падают две согласованные по времени и пространству световые волны (рис.1): E(ν_p), большей частоты ν_p – волна "накачки" и E(ν_s), меньшей частоты ν_s – "Стоксова" волна, они взаимодействуют, вызывая биения электромагнитного поля на частоте ν_p – ν_s . В случае их резонанса с колебательным состоянием определенной химической связи среды ν_p – ν_s = ν_vib происходит вынужденное рассеяние второго фотона волны накачки E(νp) на сфазированном колебательном состоянии ν_vib с генерацией новой волны E_as (2ν_p – ν_s ).

Сигнал КАРС пропорционален квадрату интенсивности волны накачки, прямо пропорционален интенсивности Стоксовой волны, квадрату вкладов в тензор χ⁽³⁾, который включает сумму откликов всех молекул, присутствующих в зоне взаимодействия в фокальной перетяжке лазерного излучения. КАРС-сигнал пропорционален соответственно квадрату концентрации молекул, вносящих вклад в χ⁽³⁾. Это позволяет при определенных условиях с учетом селективности и неинвазивности метода использовать КАРС для количественных измерений концентрации химической субстанции в образце.

Примеры применения КАРС-микроскопии для получения изображений биологических объектов

Упрощенная схема микроскопа, в котором используется сигнал КАРС, приведена на рис.2.

Для оценки пространственного разрешения микроскопа использовался образец водно-дисперсионного раствора полистириновых микросфер, помещенный в стандартный микроскоп-слайд (стеклянная подложка толщиной 1 мм – двухсторонняя, самоклеющаяся пластиковая прокладка толщиной 100 мкм и покровное стекло толщиной 170 мкм). Образец представлял собой слабоконцентрированную смесь полистириновых микросфер с калиброванным диаметром 1587±25, 760±10 и 535±10 нм.

Как видно (рис.3б), шарики в 760 и 535 мкм четко различимы (на рисунке приведен разброс значений диаметров). Оценочная величина пространственного разрешения F-КАРС-изображения составляет порядка 200 нм, что хорошо согласуется с представлением о нелинейной природе формирования изображения и о возможности его превышения относительно оптического разрешения, определяемого критерием Релея.